如果您曾经在分子生物学实验室呆过一段时间，那么您很可能已经打开了一个装满限制性内切酶的冰箱。然而，这些日子可能很快就会成为过去，因为CRISPR-Cas核酸酶以可编程的方式切割DNA，在体外分子应用中提供优于限制酶的优势。

但CRISPR-Cas核酸酶也有其缺陷，特别是需要识别与目标位点相邻的短DNA基序，称为原型间隔子相邻基序(PAM)。对靠近目标站点的PAM的可用性的依赖性禁止精确切割并限制DNA底物的序列靶向性。

一项新的研究表明，SpCas9变体SpRY在体外是无PAM的，并且可以在几乎任何序列上切割DNA，包括难以用野生型SpCas9切割的位点。该研究由哈佛医学院博士后研究员兼麻省总医院研究员KathleenA.Christie博士领导，说明了SpRYDNA消化物(SpRYgests)的多功能性和有效性，可提高多种克隆工作流程的精确度，包括那些限制酶或规范的CRISPR核酸酶不可能做到这一点。

资深作者BenjaminKleinstiver博士，麻省总医院病理学助理研究员和哈佛医学院病理学助理教授。

分子克隆技术的细微差别和挑战一直是许多研究人员的斗争，包括资深作者、麻省总医院助理研究员和哈佛医学院助理教授BenKleinstiver博士。Kleinstiver告诉GEN：“受制于一系列限制性内切酶(它们甚至连在一起都不允许在任何你想要的地方切割DNA)是令人沮丧的。”“我在KeithJoung的实验室做博士后期间，实习生NicolasWyvekens和我梦想着尝试重新利用argonaute蛋白质以实现更简单和不受约束的DNA消化的方法。”

尽管其他团体在该领域取得了进展，但仍存在一些挑战。当Kleinstiver几年前开始他的实验室时，该团队试图构建第一个CRISPR-Cas酶，它可以读取整个基因组并且不再需要特定的原型间隔子相邻基序(PAM)来编辑DNA。在2020年发表的一篇科学文章中，该小组展示了SpRY的发展。在这项工作中，Kleinstiver的团队发现，在人类细胞中，SpRY更喜欢带有NRNPAM的位点，而靶向带有NYNPAM的位点的能力较弱(其中N=任何碱基，R=A或G，Y=C或T)。

Kleinstiver说：“从那时起，我们意识到除了在人类细胞中编辑DNA之外，我们还可以将这种酶用于许多事情。”“因此，我们将注意力转向将PAMlessSpRY重新用于分子克隆应用，因为SpRY在其gRNA之外缺乏序列要求，原则上应该克服不完全的重定向能力和先前方法的其他问题(如限制酶、argonaute蛋白或传统的CRISPR-Cas酶)。”

谦虚的SpRY

在体外测试SpRY时，由科视领导的研究团队惊讶地发现它本质上是无PAM的。这一发现克服了在任何特定碱基切割DNA的剩余障碍。

SpRYgest反应的概述和优势。SpRYgests能够在任何位点以高效率和高特异性切割DNA。

该方法将发表在我们的手稿中，Kleinstiver希望它能让任何人练习SpRYgests。“寡核苷酸可以从供应商处购买，gRNA转录试剂盒已经上市，我们希望很快供应商也能提供这种蛋白质(但与此同时，我们提供了纯化SpRY酶的详细信息)，”克莱因斯蒂弗说。“我们希望这种方法的简单性将使用户能够将SpRYgests整合到他们典型的分子克隆工作流程中，而不会遇到太多挑战。”

SpRYgest：最好的体外DNA消化?

Kleinstiver设想了一个简化的SpRY套件，用户可以简单地将寡核苷酸插入到解决方案中，这也很方便，使SpRYgests能够在各种应用中实施。“例如，对于分子克隆等典型方法，其中质粒片段互换，SpRYgests可以与等温组装方法(即Gibson组装)配对，以简化和提高方法的精度，”Kleinstiver告诉GEN。

Kleinstiver表示，SpRYgest还将简化和加快更复杂的克隆方法，例如构建饱和诱变文库。“让公司合成这些库可能非常昂贵(数千到数万美元)，”Kleinstiver告诉GEN。“我们证明SpRYgest能够在几天内以几十美元的价格生成这些库。”

除了分子克隆，Kleinstiver说SpRYgests解锁了在任何用户指定位置切割DNA的能力，这对于DNA文库构建或序列耗尽(用于下一代测序方法)和许多其他应用很有用。